關于熒光PCR試劑盒,那些不得不說的事
瀏覽次數(shù):16發(fā)布日期:2025-07-09
熒光PCR試劑盒在現(xiàn)代分子生物學領域占據(jù)著關鍵地位,其以準確、靈敏且高效的特性,為基因檢測、病原體鑒定、遺傳分析等諸多研究與應用提供了強有力的技術支撐。深入探究其基本工作原理與顯著優(yōu)點,有助于我們更好地理解并運用這一強大工具。熒光PCR技術是在常規(guī)PCR基礎上,通過引入熒光標記的探針或染料,實現(xiàn)對PCR擴增過程的實時監(jiān)測。在反應體系中,除了常規(guī)的模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶以及dNTPs等成分外,還包含特定的熒光物質。
(一)熒光探針法
該方法利用特異性寡核苷酸探針,其兩端分別標記熒光基團和淬滅基團。在未進行PCR擴增時,探針保持完整,熒光基團靠近淬滅基團,后者通過熒光共振能量轉移(FRET)抑制熒光發(fā)射,此時檢測不到熒光信號。當PCR反應進行到退火步驟時,引物與模板結合并延伸,TaqDNA聚合酶的5'→3'外切酶活性會切斷探針,使得熒光基團與淬滅基團分離,熒光信號得以釋放并被檢測系統(tǒng)捕捉。隨著每個循環(huán)新鏈合成,更多探針被切斷,熒光強度逐漸增強,且該強度與擴增產(chǎn)物量呈正相關,借此可對目標DNA進行定量分析。
(二)SYBR Green I 染料法
SYBR Green I 是一種能特異性結合雙鏈 DNA 小溝的熒光染料。在 PCR 反應初期,由于沒有雙鏈 DNA 生成,SYBR Green I 以游離態(tài)存在,熒光信號微弱。隨著 PCR 循環(huán)的推進,模板 DNA 不斷擴增形成雙鏈,SYBR Green I 與之結合后,構象改變導致熒光大大增強。不過,這種染料也能與非特異性雙鏈 DNA 結合,所以在實驗中常需通過熔解曲線分析來區(qū)分特異性擴增產(chǎn)物與非特異性擴增或引物二聚體。熔解曲線是通過逐漸升高溫度使雙鏈 DNA 解鏈,同時監(jiān)測熒光變化而繪制,特異性擴增產(chǎn)物的熔解溫度相對恒定,據(jù)此可驗證反應的特異性。
熒光pcr試劑盒的使用注意事項:
1.試劑方面
-嚴格按照說明書操作:使用試劑盒前仔細閱讀說明書,按說明書要求進行樣本采集、處理、儲存和運輸?shù)炔僮?,如血液樣本需用特定抗凝管采集,組織樣本要及時處理,所有樣本低溫儲存運輸防DNA降解。
-避免試劑污染與交叉污染:使用無菌技術和一次性移液器槍頭、吸頭,不同實驗試劑分開存放并標記清楚;定期對實驗室清潔消毒,減少環(huán)境中微生物污染;注意試劑的保存條件,一般需在-20℃以下保存,避免反復凍融影響試劑活性。
-試劑使用前處理:使用前將試劑混勻,確保性能穩(wěn)定可靠,可定期對試劑進行質檢。
2.實驗操作方面
-防止樣本污染:實驗人員應戴一次性手套、帽子等,避免頭發(fā)、皮膚細胞等污染樣本;樣品處理時盡量使用較長吸頭取樣,防止移液器污染導致交叉污染;加樣后將熒光定量PCR管瞬時離心,不要在管上做標志,手勿碰管蓋采光部位。
-準確加樣與操作規(guī)范:移液器使用前確保量程合適并校準準確,加樣時保持垂直緩慢吸取液體避免氣泡和誤差;配制反應液時試劑置于冰上,避免強光照射,所有試劑加到管底,配制完畢后低速離心數(shù)秒;分樣前樣品瞬離,加樣時關閉生物安全柜照明,在冰盒上操作,盡量避免直射光源。
-嚴格控制反應條件:根據(jù)目標分子和試劑盒要求準確設置PCR反應的溫度、時間和循環(huán)次數(shù)等條件,以確保反應的特異性和效率。
3.實驗室環(huán)境與設備方面
-實驗室分區(qū)管理:實驗室應實行嚴格的分區(qū)管理制度,如試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)等明確區(qū)分,各區(qū)域設備、物品不混用,工作人員離開各區(qū)域時不得將工作服帶出,清潔按特定方向進行,不同區(qū)域有各自清潔用具防止交叉污染。
-設備維護與校準:定期對熒光定量PCR儀進行清潔、消毒、校準和檢修,確保其性能穩(wěn)定可靠,保證熒光信號檢測的準確性;儀器使用時注意安全操作,避免意外事故。